一、α-氨基酸檢測原理

a-氨基酸的a位碳原子上連有氨基和羧基，故為兩性物質(zhì)，但在水溶液里兩者離解趨勢(shì)很小，溶液酸堿性均不明顯（如氨基乙酸的羧基電離H+的Ka=2.5×10-10，氨基接收H+的Kb=2.2×10-12），故在水溶液中無法進(jìn)行準(zhǔn)確的滴定。但在非水介質(zhì)中有可能被準(zhǔn)確滴定。如在冰醋酸體系中，用HCIO4的HAc溶液作滴定劑，結(jié)晶紫作指示劑，可準(zhǔn)確滴定α-氨基酸。滴定后生成物為呈酸性的a-

氨基酸的高氨酸鹽。結(jié)晶紫在強(qiáng)酸性介質(zhì)中為黃色，pH=2左右為藍(lán)色，pH>3時(shí)為紫色，因而在此強(qiáng)酸滴定弱堿的反應(yīng)中，一般選由紫色變?yōu)榉€(wěn)定的藍(lán)綠色或藍(lán)色為終點(diǎn)，若溶液呈現(xiàn)綠色或黃色則滴定過量，在確定終點(diǎn)時(shí)，可用電位計(jì)作參比。

若試樣難溶于冰醋酸，可加入一定量甲酸作助溶劑，也可加入過量HCIO4-冰醋酸，待樣品溶解完全后用NaAc-冰醋酸返滴過量的HCIO4。HCIO4-冰醋酸滴定劑常用鄰苯二甲酸氫鉀作基準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)定。

二、a-氨基酸檢測儀器和試劑

1.儀器：3.000mL微型滴定管，50mL容量瓶，20mL錐形瓶，干燥小燒杯。

2.試劑：

（1）HCIO4-冰醋酸（0.1mol/L）：在低于25℃的250mL冰醋酸中緩慢邊攪拌邊加入2mL原裝（70%~72%）HCIO4，混勻后小心加入4mL乙酸酐，攪拌均勻，冷至室溫，放置過夜使水分與乙酸反應(yīng)完全。

（2）鄰苯二甲酸氫鉀基準(zhǔn)物質(zhì)：在105~110℃條件下干燥2h，在干燥器中用廣口瓶保存?zhèn)溆谩?/p>

（3）結(jié)晶紫（2gL-1）冰酯酸溶液

（4）冰醋酸（A.R）（5）乙酸酐（A.R）

（6）甲酸（A.R）（7）a-氨基酸試樣

三、α-氨基酸檢測實(shí)驗(yàn)步驟

1.HCIO4冰醋酸滴定劑的標(biāo)定

準(zhǔn)確稱取0.5g左右KHC8H404于小燒杯中，加入30mL冰醋酸，溶解后定量轉(zhuǎn)移至50mL量瓶內(nèi)，用冰醋酸稀釋至刻度，搖勻。移取2mL于錐形瓶內(nèi)，加1滴結(jié)晶紫指示劑，用HCIO4-冰醋酸滴定至紫色轉(zhuǎn)變?yōu)樗{(lán)綠色，即為終點(diǎn)，平行測定3~5份，各次相對(duì)偏差應(yīng)≤±0.2%。

四、α-氨基酸檢測注意事項(xiàng)

1.冰醋酸中的pH值定義與水中相同，但具體數(shù)值有區(qū)別，指示劑變色范圍在HAC中與在水中有區(qū)別。

2.乙酸酐可與水反應(yīng)生成乙酸，脫去試液中的水分。

3.在非水體系中，甲基紫和結(jié)晶紫變化狀態(tài)相同，可以用甲基紫代替結(jié)晶紫作指示劑。

4.冰醋酸在低于15℃時(shí)會(huì)凝回結(jié)冰，而液態(tài)冰醋酸體積受溫度影響較大，故本實(shí)驗(yàn)適宜在天氣較暖的春、秋季或有空調(diào)的房間內(nèi)進(jìn)行。

5.α-氨基酸可選乙氨酸（式量75.07）、丙氨酸（89.09）、谷氨酸（147.13）、異白氨酸（131.13）等易溶于冰醋酸的氨基酸。

6.在非水滴定中儀器必須干燥，否則會(huì)影響測定結(jié)果。